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一、流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史

　　流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry, FCM）是一種可以對(duì)細(xì)胞或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行快速測(cè)量的新型分析技術(shù)和分選技術(shù)。其特點(diǎn)是：①測(cè)量速度快，*快可在1秒種內(nèi)計(jì)測(cè)數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；②可進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，可以對(duì)同一個(gè)細(xì)胞做有關(guān)物理、化學(xué)特性的多參數(shù)測(cè)量，并具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③是一門綜合性的高科技方法，它綜合了激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、圖像技術(shù)等從多領(lǐng)域的知識(shí)和成果；④既是細(xì)胞分析技術(shù)，又是精確的分選技術(shù)。

　　概要說(shuō)來(lái)，流式細(xì)胞術(shù)主要包括了樣品的液流技術(shù)、細(xì)胞的分選和計(jì)數(shù)技術(shù)，以及數(shù)據(jù)的采集和分析技術(shù)等。FCM目前發(fā)展的水平凝聚了半個(gè)世紀(jì)以來(lái)人們?cè)谶@方面的心血和成果。

　　1934年，Moldavan₁首次提出了使懸浮的單個(gè)血紅細(xì)胞等流過(guò)玻璃毛細(xì)管，在亮視野下用顯微鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)，并用光電記錄裝置計(jì)測(cè)的設(shè)想，在此之前，人們還習(xí)慣于測(cè)量靜止的細(xì)胞，因?yàn)橐�使單個(gè)細(xì)胞順次流過(guò)狹窄管道容易造成較大的細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊的淤阻。1953年Crosland –Taylor根據(jù)雷諾對(duì)牛頓流體在圓形管中流動(dòng)規(guī)律的研究認(rèn)識(shí)到：管中軸線流過(guò)的鞘液流速越快，載物通過(guò)的能力越強(qiáng)，并具有較強(qiáng)的流體動(dòng)力聚集作用。于是設(shè)計(jì)了一個(gè)流動(dòng)室，使待分析的細(xì)胞懸浮液都集聚在圓管軸線附近流過(guò)，外層包圍著鞘液；細(xì)胞懸浮液和鞘液都在作層液。這就奠定了現(xiàn)代流式細(xì)胞術(shù)中的液流技術(shù)基礎(chǔ)。

　　1956年，Coulter在多年研究的基礎(chǔ)上利用Coulter效應(yīng)生產(chǎn)了Coulter 計(jì)數(shù)器。其基本原理是：使細(xì)胞通過(guò)一個(gè)小孔，只在細(xì)胞與懸浮的介質(zhì)之間存在著導(dǎo)電性上的差異，便會(huì)影響小孔道的電阻特性，從而形成電脈沖信號(hào)，測(cè)量電脈沖的強(qiáng)度和個(gè)數(shù)則可獲得有關(guān)細(xì)胞大小和數(shù)目方面的信息。1967年Holm等設(shè)計(jì)了通過(guò)汞弧光燈激發(fā)熒光染色的細(xì)胞，再由光電檢測(cè)設(shè)備計(jì)數(shù)的裝置。1973年Steinkamp設(shè)計(jì)了一種利用激光激發(fā)雙色熒光色素標(biāo)記的細(xì)胞，既能分析計(jì)數(shù)，又能進(jìn)行細(xì)胞分選的裝置。這樣就基本完成了現(xiàn)代FCM計(jì)數(shù)技術(shù)的主要?dú)v程。

　　現(xiàn)代的FCM數(shù)據(jù)采集和分析技術(shù)是從組織化學(xué)發(fā)源的，其開(kāi)拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在組織化學(xué)的基礎(chǔ)上提出了兩個(gè)新設(shè)想：（1）細(xì)胞的組分是可以用光光度學(xué)來(lái)定量測(cè)定的，即分光光度術(shù)可以定量地獲得有關(guān)細(xì)胞組織化學(xué)的重要信息。（2）細(xì)胞的不同組分可以同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，從而可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分類。換句話說(shuō)，對(duì)同一細(xì)胞可以同時(shí)獲得有關(guān)不同組分的多方面信息，用作鑒別細(xì)胞的依據(jù)。Kamentsky不僅思路敏捷，而且能身體力行。他是個(gè)把計(jì)算機(jī)接口接到儀器上并記錄分析了多參數(shù)數(shù)據(jù)的人，也是個(gè)采用了二維直方圖來(lái)顯示和分析多參數(shù)的人。

　　流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞化學(xué)中的應(yīng)用的先驅(qū)者是Van Dilla和美國(guó)的Los Alamos小組。他們?cè)?967年研制出流液束、照明光軸、檢測(cè)系統(tǒng)光軸三者相互正交的流式細(xì)胞計(jì)的基礎(chǔ)上，首次用熒光Feulgen反應(yīng)對(duì)DNA染色顯示出DNA的活性與熒光之間存在著線性關(guān)系，并在DNA的直方圖上清楚地顯示出細(xì)胞周期的各個(gè)時(shí)相。Gohde 和Dittrich接著把這項(xiàng)技術(shù)推向?qū)嵱茫�他們用流式�?xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期借以研究細(xì)胞藥代動(dòng)力學(xué)問(wèn)題。FCM用于免疫組織化學(xué)中的關(guān)鍵是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，其它和在細(xì)胞化學(xué)的應(yīng)用并沒(méi)有多大差異。

　　近20年來(lái)，國(guó)內(nèi)外在FCM上都做了不少的研究和應(yīng)用工作，也取得了不少成果。特別是隨著儀器和方法和日臻完善，人們?cè)絹?lái)越致力于樣品制備、細(xì)胞標(biāo)記、軟件開(kāi)發(fā)等方面的工作以擴(kuò)大FCM的應(yīng)用領(lǐng)域和使用效果。FCM在免疫組織化學(xué)中的應(yīng)用也大致差不多，并注重了在臨床應(yīng)用的推廣。

　　二、流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理

　　流式細(xì)胞計(jì)是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行自動(dòng)分析和分選的裝置。它可以快速測(cè)量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細(xì)胞的一系列重要的生物物理、生物化學(xué)方面的特征參量，并可以根據(jù)預(yù)選的參量范圍把指定的細(xì)胞亞群從中分選出來(lái)。多數(shù)流式細(xì)胞計(jì)是一種零分辨率的儀器，它只能測(cè)量一個(gè)細(xì)胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標(biāo)，而不能鑒別和測(cè)出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說(shuō)，它的細(xì)節(jié)　分辨率為零。國(guó)外又把流式細(xì)胞計(jì)稱作熒光激活細(xì)胞分選器（Flu－orescence Activated Cell Sorter, FACS）。美國(guó)Becton—Dickinson 公司生產(chǎn)的流式細(xì)胞計(jì)系列均冠以FACS字頭。目前我國(guó)國(guó)內(nèi)使用的儀器多為美國(guó)、西歐及日本等國(guó)的產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)有些單位也已研制成功，但尚無(wú)定型產(chǎn)品面市。

　　1．流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu)流式細(xì)胞計(jì)主要由四部分組成。它們是：流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測(cè)系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)。圖10-1為其結(jié)構(gòu)示意圖。

　�。�1）流動(dòng)室和液流系統(tǒng)：流動(dòng)室由樣品管、鞘液管和噴嘴等組成，常用光學(xué)玻璃、石英等透明、穩(wěn)定的材料制作。設(shè)計(jì)和制作均很精細(xì)，是液流系統(tǒng)的心臟。樣品管貯放樣品，單個(gè)細(xì)胞懸液在液流壓力作用下從樣品管射出；鞘液由鞘液管從四周流向噴孔，包圍在樣品外周后從噴嘴射出。為了保證液流是穩(wěn)液，一般限制液流速度υ<10m/s。由于鞘液的作用，被檢測(cè)細(xì)胞被限制在液流的軸線上。流動(dòng)室上裝有壓電晶體，受到振蕩信號(hào)可發(fā)生振動(dòng)。

　　（2）激光源和光學(xué)系統(tǒng)：經(jīng)特異熒光染色的細(xì)胞需要合適的光源照射激發(fā)才能發(fā)出熒光供收集檢測(cè)。常用的光源有弧光燈和激光；激光器又以氬離子激光器為普遍，也有配和氪離子激光器或染料激光器。光源的選擇主要根據(jù)被激發(fā)物質(zhì)的激發(fā)光譜而定。汞燈是*常用的弧光燈，其發(fā)射光譜大部分集中于300～400nm，很適合需要用紫外光激發(fā)的場(chǎng)合。氬離子激光器的發(fā)射光譜中，綠光514nm和藍(lán)光488nm的譜線*強(qiáng)，約占總光強(qiáng)的80%；氪離子激光器光譜多集中在可見(jiàn)光部分，以647nm較強(qiáng)。免疫學(xué)上使用的一些熒光染料激發(fā)光波長(zhǎng)在550nm以上，可使用染料激光器。將有機(jī)染料做為激光器泵浦的一種成份，可使原激光器的光譜發(fā)生改變以適應(yīng)需要即構(gòu)成染料激光器。例如用氬離子激光器的綠光泵浦含有Rhodamine 6G水溶液的染料激光器,則可得到550～650nm連續(xù)可調(diào)的激光，尤在590nm處轉(zhuǎn)換效率，約可占到一半。為使細(xì)胞得到均勻照射，并提高分辨率，照射到細(xì)胞上的激光光斑直徑應(yīng)和細(xì)胞直徑相近。因此需將激光光束經(jīng)透鏡會(huì)聚。光斑直徑d可由下式確定：d=4λf/πD。λ為激光波長(zhǎng)；f為透鏡焦距；D為激光束直徑。色散棱鏡用來(lái)選擇激光的波長(zhǎng)，調(diào)整反射鏡的角度使調(diào)諧到所需要的波長(zhǎng)λ。為了進(jìn)一步使檢測(cè)的發(fā)射熒光更強(qiáng)，并提高熒光訊號(hào)的信噪比，在光路中還使用了多種濾片。帶阻或帶通濾片是有選擇性地使某一濾長(zhǎng)區(qū)段的光線濾除或通過(guò)。例如使用525nm帶通濾片只允許FITC（Fluoresceinisothiocyanate,異硫氰熒光素）發(fā)射的525nm綠光通過(guò)。長(zhǎng)波通過(guò)二向色性反射鏡只允許某一波長(zhǎng)以上的光線通過(guò)而將此波長(zhǎng)以下的另一特定波長(zhǎng)的光線反射。在免疫分析中常要同時(shí)探測(cè)兩種以上的波長(zhǎng)的熒光信號(hào)，就采用二向色性反射鏡，或二向色性分光器，來(lái)有效地將各種熒光分開(kāi)。

　�。�3）光電管和檢測(cè)系統(tǒng)：經(jīng)熒光染色的細(xì)胞受合適的光激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光是通過(guò)光電轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)變成電信號(hào)而進(jìn)行測(cè)量的。光電倍增管（PMT）*為常用。PMT的響應(yīng)時(shí)間短，僅為ns數(shù)量級(jí)；光譜響應(yīng)特性好，在200～900nm的光譜區(qū)，光量子產(chǎn)額都比較高。光電倍增管的增益從10³到10⁸可連續(xù)調(diào)節(jié)　，因此對(duì)弱光測(cè)量十分有利。光電管運(yùn)行時(shí)特別要注意穩(wěn)定性問(wèn)題，工作電壓要十分穩(wěn)定，工作電流及功率不能太大。一般功耗低于0.5W；陽(yáng)極電流在幾個(gè)毫安。此外要注意對(duì)光電管進(jìn)行暗適應(yīng)處理，并注意良好的磁屏蔽。在使用中還要注意安裝位置不同的PMT，因?yàn)楣庾V響應(yīng)特性不同，不宜互換。也有用硅光電二極管的，它在強(qiáng)光下穩(wěn)定性比PMT好。

　　從PMT輸出的電信號(hào)仍然較弱，需要經(jīng)過(guò)放大后才能輸入分析儀器。流式細(xì)胞計(jì)中一般備有兩類放大器。一類是輸出信號(hào)輻度與輸入信號(hào)成線性關(guān)系，稱為線性放大器。線性放大器適用于在較小范圍內(nèi)變化的信號(hào)以及代表生物學(xué)線性過(guò)程的信號(hào)，例DNA測(cè)量等。另一類是對(duì)數(shù)放大器，輸出信號(hào)和輸入信號(hào)之間成常用對(duì)數(shù)關(guān)系。在免疫學(xué)測(cè)量中常使用對(duì)數(shù)放大器。因?yàn)樵诿庖叻治鰰r(shí)常要同時(shí)顯示陰性、陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性三個(gè)亞群，它們的熒光強(qiáng)度相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí)；而且在多色免疫熒光測(cè)量中，用對(duì)數(shù)放大器采集數(shù)據(jù)易于解釋。此外還有調(diào)節(jié)　便利、細(xì)胞群體分布形狀不易受外界工作條件影響等優(yōu)點(diǎn)。

　�。�4）計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)：經(jīng)放大后的電信號(hào)被送往計(jì)算機(jī)分析器。多道的道數(shù)是和電信號(hào)的脈沖高度相對(duì)應(yīng)的，也是和光信號(hào)的強(qiáng)弱相關(guān)的。對(duì)應(yīng)道數(shù)年縱坐標(biāo)通常代表發(fā)出該信號(hào)的細(xì)胞相對(duì)數(shù)目。多道分析器出來(lái)的信號(hào)再經(jīng)模-數(shù)轉(zhuǎn)換器輸往微機(jī)處理器編成數(shù)據(jù)文件，或存貯于計(jì)算機(jī)的硬盤和軟盤上，或存于儀器內(nèi)以備調(diào)用。計(jì)算機(jī)的存貯容量較大，可存貯同一細(xì)胞的6～8個(gè)參數(shù)。存貯于計(jì)算機(jī)內(nèi)的數(shù)據(jù)可以在實(shí)測(cè)后脫機(jī)重現(xiàn)，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，*后給出結(jié)果。除上述四個(gè)主要部分外，還備有電源及壓縮氣體等附加裝置。

　　2．流式細(xì)胞計(jì)的工作原理下面分別簡(jiǎn)要介紹流式細(xì)胞計(jì)有關(guān)的參數(shù)測(cè)量、樣品分選及數(shù)據(jù)處理等工作原理。

　�。�1）參數(shù)測(cè)量原理：流式細(xì)胞計(jì)可同時(shí)進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量，信息主要來(lái)自特異性熒光信號(hào)及非熒光散射信號(hào)。測(cè)量是在測(cè)量區(qū)進(jìn)行的，所謂測(cè)量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點(diǎn)。液流中央的單個(gè)細(xì)胞通過(guò)測(cè)量區(qū)時(shí)，受到激光照射會(huì)向立體角為2π的整個(gè)空間散射光線，散射光的波長(zhǎng)和入射光的波長(zhǎng)相同。散射光的強(qiáng)度及其空間分布與細(xì)胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因?yàn)檫@些生物學(xué)參數(shù)又和細(xì)胞對(duì)光線的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細(xì)胞對(duì)光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號(hào)對(duì)不經(jīng)染色活細(xì)胞進(jìn)行分析和分選。經(jīng)過(guò)固定的和染色處理的細(xì)胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變，其散射光信號(hào)當(dāng)然不同于活細(xì)胞。散射光不僅與作為散射中心的細(xì)胞的參數(shù)相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。

　　在流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量中，常用的是兩種散射方向的散射光測(cè)量：①前向角（即0^。角）散射（FSC）；②側(cè)向散射（SSC），又稱90^。角散射。這時(shí)所說(shuō)的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號(hào)的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說(shuō)來(lái)，前向角散射光的強(qiáng)度與細(xì)胞的大小有關(guān)，對(duì)同種細(xì)胞群體隨著細(xì)胞截面積的增大而增大；對(duì)球形活細(xì)胞經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系；對(duì)于形狀復(fù)雜具有取向性的細(xì)胞則可能差異很大，尤其需要注意。側(cè)向散射光的測(cè)量主要用來(lái)獲取有關(guān)細(xì)胞內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側(cè)向散射光雖然也與細(xì)胞的形狀和大小有關(guān)，但它對(duì)細(xì)胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對(duì)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。

　　在實(shí)際使用中，儀器首先要對(duì)光散射信號(hào)進(jìn)行測(cè)量。當(dāng)光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時(shí)，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細(xì)胞。光散射測(cè)量*有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。

　　熒光信號(hào)主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細(xì)胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；②特征熒光，即由細(xì)胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強(qiáng)度較弱，波長(zhǎng)也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號(hào)為噪聲信號(hào)，在多數(shù)情況下會(huì)干擾對(duì)特異熒光信號(hào)的分辨和測(cè)量。在免疫細(xì)胞化學(xué)等測(cè)量中，對(duì)于結(jié)合水平不高的熒光抗體來(lái)說(shuō)，如何提高信噪比是個(gè)關(guān)鍵。一般說(shuō)來(lái)，細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細(xì)胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞/活細(xì)胞比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)；細(xì)胞樣品中所含亮細(xì)胞的比例越高，自發(fā)熒光越強(qiáng)。

　　減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統(tǒng)；③采用電子補(bǔ)償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻(xiàn)予以補(bǔ)償。

　　（2）樣品分選原理：流式細(xì)胞計(jì)的分選功能是由細(xì)胞分選器來(lái)完成的。總的過(guò)程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個(gè)參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對(duì)選定細(xì)胞液滴充電，帶電液滴攜帶細(xì)胞通過(guò)靜電場(chǎng)而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來(lái)進(jìn)行分選的。

　　穩(wěn)定的小液滴是由流動(dòng)室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號(hào)作用下發(fā)生振動(dòng)而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約距約數(shù)百μm。實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)公式f=v/4.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號(hào)頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會(huì)改變分選效果。使分選的含細(xì)胞液滴在靜電場(chǎng)中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數(shù)測(cè)定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時(shí)間，一般為數(shù)十ms。精確測(cè)定延遲時(shí)間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來(lái)產(chǎn)生延遲。可根據(jù)具體要求予以適當(dāng)調(diào)整。

　　（50）數(shù)據(jù)處理原理：FCM的數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析，至于對(duì)儀器給出的結(jié)果如何解釋則隨所要解決的具體問(wèn)題而定。

　�、贁�(shù)據(jù)顯示：FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖（histogram）、二維點(diǎn)圖（dot plot）、二維等高圖（contour ）、假三維圖（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。

　　直方圖是一維數(shù)據(jù)用昨*多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線。根據(jù)選擇放大器類型不同，橫座標(biāo)可以是線性標(biāo)度或?qū)��?shù)標(biāo)度，用“道數(shù)”（Channel No .）來(lái)表示,實(shí)質(zhì)上是所測(cè)的熒光或散射光的強(qiáng)度�？v座標(biāo)一般表示的是細(xì)胞的相對(duì)數(shù)。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個(gè)參數(shù)與細(xì)胞之間的關(guān)系是它的局限性。

　　二維點(diǎn)圖能夠顯示兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)與細(xì)胞相對(duì)數(shù)之間的關(guān)系。橫座標(biāo)和縱座標(biāo)分別為與細(xì)胞有關(guān)的兩個(gè)獨(dú)立參數(shù)，平面上每一個(gè)點(diǎn)表示同時(shí)具有相應(yīng)座標(biāo)植的細(xì)胞存在（圖10-3）�？梢杂啥�維點(diǎn)圖得到兩個(gè)一維直方圖，但是由于兼并現(xiàn)象存在，二維點(diǎn)圖的信息量要大于二個(gè)一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說(shuō)多個(gè)細(xì)胞具有相同的二維座標(biāo)在圖上只表現(xiàn)為一個(gè)點(diǎn)，這樣對(duì)細(xì)胞點(diǎn)密集的地方就難于顯示它的精細(xì)結(jié)構(gòu)。

　　二維等高圖類似于地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點(diǎn)圖的不足而設(shè)置的顯示方法。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細(xì)胞相對(duì)或絕對(duì)數(shù)，即“等高”。曲線層次越高所代表的細(xì)胞數(shù)愈多。一般層次所表示的細(xì)胞數(shù)間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。圖10-4給出了二維等高圖的樣式。

　　假三維圖是利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)二維等高圖的一種視覺(jué)直觀的表現(xiàn)方法。它把原二維圖中的隱座標(biāo)—細(xì)胞數(shù)同時(shí)顯現(xiàn)，但參數(shù)維圖可以通過(guò)旋轉(zhuǎn)、傾斜等操作，以便多方位的觀察“山峰”和“谷地”的結(jié)構(gòu)和細(xì)節(jié)　，這無(wú)疑是有助于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析的。圖10-5為假三維圖的示意圖。

　　列表模式其實(shí)只是多參數(shù)數(shù)據(jù)文件的一種計(jì)算機(jī)存貯方式，三個(gè)以上的參數(shù)數(shù)據(jù)顯示是用多個(gè)直方圖、二維圖和假三維圖來(lái)完成的�？捎肔ist Mode中的特殊技術(shù)，開(kāi)窗或用游標(biāo)調(diào)出相關(guān)部分再改變維數(shù)進(jìn)行顯示。例如，“一調(diào)二”就是在一維圖上調(diào)出二維圖來(lái)；“二調(diào)一”就是從二維圖中調(diào)出一維圖來(lái)。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調(diào)出相應(yīng)窗口的直方圖的示意圖。

　　上面簡(jiǎn)要地介紹了幾種數(shù)據(jù)顯示形式，在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。

　�、跀�(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析的方法總的可分為參數(shù)方法和非參數(shù)方法兩大類。當(dāng)被檢測(cè)的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型技術(shù)時(shí)則多使用參數(shù)方法。數(shù)學(xué)模型可以是一個(gè)方程或方程組，方程的參數(shù)產(chǎn)生所需要的信息來(lái)自所測(cè)的數(shù)據(jù)。例如在測(cè)定老鼠精子的DNA含量時(shí)，可以獲取細(xì)胞頻數(shù)的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數(shù)來(lái)描述這些數(shù)據(jù)，則參數(shù)即為面積、平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。方程的數(shù)據(jù)擬合則通常使用*小二乘法。而非參數(shù)分析法對(duì)測(cè)量得到的分布形狀不需要做任何假設(shè)，即采用無(wú)設(shè)定參數(shù)分析法。分析程序可以很簡(jiǎn)單，只需要直觀觀測(cè)頻數(shù)分布；也可能很復(fù)雜，要對(duì)兩個(gè)或多個(gè)直方圖逐道地進(jìn)行比較。

　　逐點(diǎn)描圖（或用手工，或用描圖儀、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)）是大家常用的數(shù)據(jù)分析的重要手段。我們�？梢杂脕�(lái)了解數(shù)據(jù)的特性、尋找那些不曾預(yù)料的特異征兆、選擇統(tǒng)計(jì)分析的模型、顯示*終結(jié)果等。事實(shí)上，不經(jīng)過(guò)先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行直觀觀察分析就決不應(yīng)該對(duì)這批數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)值分析。從這一點(diǎn)來(lái)看，非參數(shù)分析是參數(shù)分析的基礎(chǔ)。

　　逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發(fā)現(xiàn)明顯的差異，特別是對(duì)照組和測(cè)試組�？紤]到FCM的可靠性，要注意到對(duì)每組測(cè)量，都要有對(duì)照組，對(duì)照組可以是空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、或零時(shí)刻對(duì)照組等，具體設(shè)置應(yīng)根據(jù)整體實(shí)驗(yàn)要求而定。對(duì)照組和測(cè)試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯(cuò)誤解釋。順便指出，進(jìn)行比較時(shí)對(duì)曲線的總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行歸一化處理，甚至對(duì)兩條曲線逐道相減而得到“差結(jié)果曲線”往往是適宜的。

　　因?yàn)閿?shù)據(jù)分析往往和結(jié)果解釋關(guān)系十分密切，也就是說(shuō)和生物學(xué)背景相關(guān)，因此具體的分析法和原理將在后面結(jié)合實(shí)例再介紹。

　　3．流式細(xì)胞計(jì)的技術(shù)參數(shù)　為了表征儀器性能，往往根據(jù)使用目的和要求而提出幾個(gè)技術(shù)參數(shù)或指標(biāo)來(lái)定量說(shuō)明。對(duì)于流式細(xì)胞計(jì)常用的技術(shù)指標(biāo)有熒光分辨率、熒光靈敏度、適用樣品濃度、分選純度、可分析測(cè)量參數(shù)等。

　�。�1）熒光分辨率：強(qiáng)度一定的熒光在測(cè)量時(shí)是在一定道址上的一個(gè)正態(tài)分布的峰，熒光分辨率是指兩相鄰的峰可分辨的*小間隔。通常用變異系數(shù)（C.V值）來(lái)表示。C.V的定義式為：

　　C.V=σ/μ

　　式中，σ為標(biāo)準(zhǔn)偏差，μ是平均值。

　　在實(shí)際應(yīng)用中，我們使用挖關(guān)系式σ=0.423FWHM；其中FWHM為峰在峰高一半處的峰寬值。目前儀器的熒光分辨率均優(yōu)于2.0%。

　�。�2）熒光靈敏度：反映儀器所能探測(cè)的*小熒光光強(qiáng)的大小。一般用熒光微球上所標(biāo)可測(cè)出的FITC（fluorescein isothiocyanate 異硫氰基熒光素）的*少分子數(shù)來(lái)表示。目前儀器均可達(dá)到1000左右。

　　（3）分析速度/分選速度：儀器每秒種可分析/分選的數(shù)目。一般分析速度為5000～10000；分選速度掌握在1000以下。

　�。�4）樣品濃度：主要給出儀器工作時(shí)樣品濃度的適用范圍。一般在10^5～10⁷細(xì)胞/ml的數(shù)量級(jí)。

　　其它技術(shù)參數(shù)尚多，不再一一介紹。

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　　4．流式細(xì)胞計(jì)的調(diào)試和使用　古語(yǔ)說(shuō)：“工欲善其事，必先利其器”。要想很好地應(yīng)用流式細(xì)胞分析和分選技術(shù)，必需先對(duì)儀器進(jìn)行調(diào)試，使其處于良好的工作狀態(tài)，并能正確使用儀器。下面簡(jiǎn)要介紹細(xì)胞計(jì)的調(diào)試項(xiàng)目及要點(diǎn)、使用的程序等等。

　�。�1）調(diào)試和校準(zhǔn)：流式細(xì)胞計(jì)在使用前，甚至在使用過(guò)程中都要精心進(jìn)行調(diào)試，以保證工作的可靠性和*佳性。調(diào)試的項(xiàng)目主要是激光強(qiáng)度、液流速度和測(cè)量區(qū)的光路等。

　　激光強(qiáng)度：除調(diào)整反射鏡的角度以調(diào)整到所需波長(zhǎng)的激光出光外，還要結(jié)合顯示屏上的光譜曲線使激光的強(qiáng)度輸出為。

　　液流速度：可通過(guò)操作臺(tái)數(shù)字顯示監(jiān)督，調(diào)節(jié)　氣體壓力大小以獲得穩(wěn)定的液流速度。

　　測(cè)量區(qū)光路調(diào)節(jié)�。哼@是調(diào)試工作的關(guān)鍵。需要保證在測(cè)量區(qū)的液流、激光束、90^。散射測(cè)量光電系統(tǒng)垂直正交，而且交點(diǎn)較小。一般可在用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球等校準(zhǔn)中完成。

　　流式細(xì)胞術(shù)中所測(cè)得的量是相對(duì)值，因此需要在使用前或使用中對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)或標(biāo)定，這樣才能通過(guò)相對(duì)測(cè)量獲得絕對(duì)的意義。因而FCM中的校準(zhǔn)具有雙重功能：儀器的準(zhǔn)直調(diào)整和定量標(biāo)度。標(biāo)準(zhǔn)樣品應(yīng)該穩(wěn)定，有形成份形狀應(yīng)是大小比較一致球形，樣品分散性能良好，且經(jīng)濟(jì)、容易獲得。常用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球作為非生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品，雞血紅細(xì)胞做為生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)樣品。微球用樹(shù)脂材料制作，或標(biāo)有熒光素，或不標(biāo)記熒光素。Flow Cytometry Stands公司可提供熒光強(qiáng)度藥盒，在免疫實(shí)驗(yàn)中可用來(lái)作為定量熒光標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)定每個(gè)細(xì)胞所標(biāo)記的抗原位點(diǎn)數(shù)目。所用的雞血紅細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)樣品制作過(guò)程昭下：取3.8%枸櫞酸或肝素抗凝的雞血（抗凝劑：雞血=1：4），經(jīng)PBS清洗3次，再用5～10ml的1.0%戊二醛與清洗后的雞紅細(xì)胞混合，室溫下振蕩醛化24h，*后經(jīng)PBS再清洗，貯4℃冰箱中備用。需要指出的是因?yàn)槲唇?jīng)熒光染色，所測(cè)光信號(hào)為雞血紅蛋白的自發(fā)熒光。

　�。�2）儀器的操作和使用：

　　①打開(kāi)電源，對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)熱；

　�、诖蜷_(kāi)氣體閾，調(diào)節(jié)　壓力，獲得適宜的液流速度；開(kāi)啟光源冷卻系統(tǒng)；

　�、墼跇悠饭苤屑尤肴ルx子水，沖洗液流的噴嘴系統(tǒng)；

　　④利用校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣品，調(diào)整儀器，使在激光功率、光電倍增管電壓、放大器電路增益調(diào)定的基礎(chǔ)上，0^。和90^。散射的熒光強(qiáng)度*強(qiáng)，并要求變異系數(shù)為*��；

　　⑤選定流速、測(cè)量細(xì)胞數(shù)、測(cè)量參數(shù)等，在同樣的工作條件下測(cè)量樣品和對(duì)照樣品；同時(shí)選擇計(jì)算機(jī)屏上數(shù)據(jù)的顯示方式，從而能直觀掌握測(cè)量進(jìn)程；

　�、迾悠窚y(cè)量完畢后，再用去離子水沖洗液流系統(tǒng)；

　�、咭�?yàn)閷?shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已存入計(jì)算機(jī)硬盤（有的機(jī)器還備有光盤系統(tǒng)，存貯量更大），因此可關(guān)閉氣體、測(cè)量裝置，而單獨(dú)使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；

　�、鄬⑺�需結(jié)果打印出來(lái)。

　　在操作和使用中一定要注意如下事項(xiàng)：　

　　1）光電倍增管要求穩(wěn)定的工作條件，暴露的較強(qiáng)的光線下以后，需要較長(zhǎng)時(shí)間的“暗適應(yīng)”以消除或降低部分暗電流本底才能工作；另外還要注意磁屏蔽；

　　2）光源不得在短時(shí)間內(nèi)（一般要1h左右）關(guān)上又打開(kāi)；使用光源必須預(yù)熱并注意冷卻系統(tǒng)工作是否正常；

　　3）液流系統(tǒng)必需隨時(shí)保持液流暢通，避免氣泡栓塞，所使用的鞘流液使用前要經(jīng)過(guò)過(guò)濾、消毒；

　　4）注意根據(jù)測(cè)量對(duì)象的變換選用合適的濾片系統(tǒng)、放大器的類型等；

　　5）特別強(qiáng)度每次測(cè)量都需要對(duì)照組。

　　本節(jié)　著重介紹了流式細(xì)胞計(jì)的基本結(jié)構(gòu)和工作原理、技術(shù)指標(biāo)及使用操作中的基本問(wèn)題。由于實(shí)際使用的儀器廠家、型號(hào)差別很大，不能一一介紹，可參照儀器使用說(shuō)明書(shū)使用。至于流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程和免疫組織化學(xué)應(yīng)用中的一些具體技術(shù)途徑則在下節(jié)　詳細(xì)介紹。

第二節(jié)　FCM在生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)方面的應(yīng)用

　　流式細(xì)胞術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)以及臨床腫瘤學(xué)、臨床血液學(xué)等諸多領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用。本節(jié)　概要介紹它們的技術(shù)途徑及主要原理，大家可以從中看出它們是和細(xì)胞化學(xué)密切相關(guān)的。

　　一、FCM應(yīng)用的技術(shù)途徑

　　FCM是通過(guò)測(cè)量細(xì)胞的多種參量來(lái)獲取信息的。細(xì)胞參數(shù)分為結(jié)構(gòu)參量和功能參量?jī)纱箢悺＝Y(jié)構(gòu)參量主要用于描述細(xì)胞的化學(xué)組分和形態(tài)特征；功能參量主要是描述細(xì)胞整體的理化和生物特性。這些參量有的需要經(jīng)熒光標(biāo)記方可測(cè)定，有的并不需要熒光標(biāo)記。DNA以及RNA的含量，蛋白總含量、胞內(nèi)pH值和細(xì)胞大小等為結(jié)構(gòu)參數(shù)；細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)、特殊配體的鑒定、特殊細(xì)胞的生物活性等則為功能參數(shù)。

　　1．DNA和RNA的測(cè)量和分析DNA和RNA的含量可以用多種熒光探針標(biāo)記后測(cè)出。對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA含量的測(cè)定可用于細(xì)胞生物學(xué)方面的研究和臨床腫瘤學(xué)的診斷；測(cè)量RNA的含量可用于血液中的網(wǎng)織紅細(xì)胞的檢測(cè)和計(jì)數(shù)；DNA和RNA含量的測(cè)定可以用于區(qū)別細(xì)胞周期中的G₀和G₁期。常用的熒光探針有吖啶橙（AO，Acridine·orange）、派洛寧Y（PY，Pyronine Y）、HO（Hoechst）系列和色霉素A₃（CA₃）等。利用HO/CA₃雙染色還可分析DNA的堿基組成。還可以結(jié)合Brdu （Bromodeoxyuridine, 溴脫氧尿嘧啶核苷）單克隆抗體免疫熒光來(lái)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)DNA合成。

　　2．蛋白質(zhì)總量測(cè)定用FCM可以測(cè)定細(xì)胞中蛋白的總含量，以檢測(cè)一個(gè)細(xì)胞群體生長(zhǎng)和代謝的狀態(tài)，或區(qū)別具有不同蛋白含量的細(xì)胞亞群，如血液中的白細(xì)胞的分類。檢測(cè)總蛋白的常用熒光探針為異硫氰基熒光素（FITC，F(xiàn)luorescein isothiocyanate），F(xiàn)ITC以共價(jià)鍵方式與蛋白上帶正電的殘基結(jié)合。

　　3．特殊配體的測(cè)定配體是與不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異結(jié)合很強(qiáng)的各種大分子和小分子，通過(guò)對(duì)特異性的熒光標(biāo)記的配體的測(cè)定可以獲得不少有關(guān)結(jié)構(gòu)參量和功能參量的信息。例如用標(biāo)記的外源凝集素可檢測(cè)細(xì)胞表面糖；用標(biāo)記抗體可測(cè)表面抗原；用標(biāo)記多聚陽(yáng)離子可檢測(cè)細(xì)胞表面電荷；用標(biāo)記的激素、生長(zhǎng)因子、神經(jīng)遞質(zhì)和病毒等可檢測(cè)細(xì)胞受體；用標(biāo)記的大分子、微生物等可檢測(cè)細(xì)胞的內(nèi)吞性；用熒光素標(biāo)記的親和素以及帶有DUTP的生物素衍生物的DNA探針跟靶細(xì)胞的DNA雜交能夠檢測(cè)原位的特殊基因等。這方面的應(yīng)用范圍廣、有前途，已經(jīng)成為研究細(xì)胞和組織中的抗原、基因和各種生化過(guò)程的強(qiáng)有力的新技術(shù)。用于這方面工作的熒光探針主要有FITC、若丹明系列（如四甲基異硫氰基若丹明TRITC、異硫氰基若丹明X-RITc 和美國(guó)德州紅等）、藻膽蛋白系列等。由于各種熒光探針具有不同的光譜特性，在使用中要注意正確地使用激光光源和濾片。

　　4．生物活性的測(cè)定就生物流行性來(lái)說(shuō)，主要包括兩方面工作：①細(xì)胞本身的死活；②活細(xì)胞生物功能發(fā)揮的強(qiáng)弱。前項(xiàng)工作單一，后項(xiàng)工作要復(fù)雜得多。FCM用來(lái)判斷細(xì)胞死活的常用熒光探針有二大類：一類是能透過(guò)活的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)而發(fā)出熒光的物質(zhì)；例如下醋酸酯熒光素（FDA，flourescein Diacetate）它可被活細(xì)胞持留而發(fā)出黃綠色熒光；若細(xì)胞有損傷則會(huì)從細(xì)胞中流失，觀察不到熒光。另一類是不能透過(guò)活細(xì)胞膜，但能對(duì)固定的細(xì)胞及膜有破損的細(xì)胞的核進(jìn)行染色，例如碘化丙啶（PI,Propidium iodide）和溴化乙錠（EB,Ethidium bromide ）就是常用的第二類熒光探針。

　　用FCM來(lái)測(cè)定活細(xì)胞生物功能發(fā)揮方面和性能的指標(biāo)很多。例如可用來(lái)測(cè)細(xì)胞膜電位、細(xì)胞內(nèi)pH值和細(xì)胞內(nèi)鈣等，這些都和細(xì)胞的激活密切相關(guān)。FCM也可用來(lái)測(cè)膜結(jié)構(gòu)的流動(dòng)性或微粘度等。有報(bào)告可以用FCM代替⁵¹Cr的放射免疫分析來(lái)測(cè)定天然殺傷細(xì)胞（NK, Natu-ral killer cells）對(duì)靶細(xì)胞毒理學(xué)活性的大小。

　　二、FCM的典型應(yīng)用簡(jiǎn)介

　　下面簡(jiǎn)單介紹FCM在各個(gè)領(lǐng)域中應(yīng)用的典型實(shí)例，以求對(duì)FCM應(yīng)用的全面了解，并能深入了解FCM在免疫細(xì)胞化學(xué)中應(yīng)用的背景。

　　1．在細(xì)胞生物學(xué)方面的應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)是FCM應(yīng)用*廣泛也是*基本的領(lǐng)域，細(xì)胞周期分析是其基本分析內(nèi)容，而實(shí)施的技術(shù)途徑是通過(guò)測(cè)定細(xì)胞周期各時(shí)相的DNA含量來(lái)達(dá)到的。

　　眾所周知，細(xì)胞周期由G₁期、S期、G₂期和M期所構(gòu)成的。各期細(xì)胞的DNA含量如下：G₁期為2C，G₂期和M期為4C，S期則在2C到4C之間。所以在FCM的DNA直方圖上形成的譜線則為峰分布，而且G₁峰的道數(shù)恰好是G₂和M峰道數(shù)的一半（圖10-7）。研究表明：對(duì)于正常細(xì)胞群，各周期時(shí)相的細(xì)胞數(shù)的比例是同一的；對(duì)于惡性病變的細(xì)胞群則是非均一的（圖10-8）。

　　臨床腫瘤病學(xué)已經(jīng)注意到細(xì)胞動(dòng)力學(xué)的重要性。研究工作表明：腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療的敏感程度與細(xì)胞的增生率高低密切相關(guān)；采取細(xì)胞同步化（Cell Synchronization）措施可以提高療效。例如可以使用雌激素這種外源性藥物讓雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞同步化。

　　臨床微生物學(xué)可以用FCM對(duì)大量細(xì)菌的DNA和RNA含量進(jìn)行測(cè)量，進(jìn)行微生物鑒定、醫(yī)學(xué)常規(guī)中的細(xì)菌抗生素敏感試驗(yàn)和傳染活性的測(cè)定。

　　FCM優(yōu)良的分析和分選功能在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域也能充分發(fā)揮。例如流式細(xì)胞核型分析技術(shù)就是用FCM對(duì)染色體進(jìn)行分類、純化，檢測(cè)或定量測(cè)量細(xì)胞表面或內(nèi)部由特異基本所編碼的成份。這方面的成果已用在畜類性別的預(yù)選擇，以及對(duì)人類計(jì)劃生育等方面的工作。

　　2．在免疫學(xué)方面的應(yīng)用　FCM以它的快速、靈活及定量的特點(diǎn)被廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的各個(gè)方面，尤其是結(jié)合單克隆抗體技術(shù)，在免疫分型、分選、腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)測(cè)、機(jī)體免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)、免疫細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)生及特性研究等方面更能起到重要作用，成為現(xiàn)代免疫技術(shù)的重要組成部分�；�于免疫技術(shù)是免疫細(xì)胞化學(xué)分析技術(shù)的基礎(chǔ)，我們著重介紹FCM在免疫應(yīng)用中的技術(shù)問(wèn)題。

　�。�1）免疫應(yīng)用的激發(fā)光源和濾片系統(tǒng)：適用于免疫技術(shù)的FCM的激發(fā)光是氪離子氣體激光器，光譜中波長(zhǎng)為531nm和856nm的譜線*強(qiáng)。為了擴(kuò)大儀器對(duì)雙標(biāo)記或三標(biāo)記染色的熒光信號(hào)的分辨范圍可使用雙激光光源。

　　為了減少細(xì)胞由于激光束造成的散射光對(duì)光電倍增管的影響，要使用貼有干涉膜的濾片系統(tǒng)。為了同時(shí)測(cè)定兩種波長(zhǎng)以上的熒光信號(hào)，光路中還要使用二向性分光元件。

　　為了測(cè)定伴隨細(xì)胞轉(zhuǎn)化過(guò)程所產(chǎn)生的早期免疫及生化性質(zhì)的改變，例如膜的流行性，DNA構(gòu)象變化等，可以使用偏振片。

　　總之，應(yīng)用于免疫學(xué)時(shí)要充分考慮有關(guān)光源及光學(xué)濾片系統(tǒng)的正確使用。

　　（2）免疫應(yīng)用的熒光染料及染色：免疫應(yīng)用中的熒光染料主要有FITC（488nm）、TRITC（515nm）、PE（藻紅蛋白，575nm）及其組合。在進(jìn)行多種標(biāo)記時(shí)特別要注意結(jié)合抗體的每種色素都不干擾抗體反應(yīng)的特異性，也不相互干擾。

　　免疫熒光染色有直接法和間接法二類：

　�、僦苯尤旧�法

　　1）取約10⁶的細(xì)胞置于尖底離心管內(nèi)，管內(nèi)液體要少些。加熒光標(biāo)記抗體，在4℃溫度下靜置15～30min。若作雙標(biāo)記染色也可直接加入。

　　2）用冷的10%的小牛血清、0.1%的疊氮鈉溶液，1/15mol/L的PBS（pH4.4）離心清洗細(xì)胞2次。1000rpm離心5min或4000rpm離心1min。

　　3）加入適量緩沖液待測(cè)。

　�、陂g接染色法：

　　1）取10⁶細(xì)胞加特異的抗體，4^℃溫度下靜置15～30min。

　　2）加緩沖液離心清洗2次后，吸盡殘留液體，彈散沉淀，加入熒光標(biāo)記的第二抗體，4^℃靜置30　min。

　　3）緩沖液離心清洗2次后加入適量緩沖液待測(cè)。為減少無(wú)關(guān)因素干擾，操作盡量在水浴中進(jìn)行。

　　染色中應(yīng)注意的事項(xiàng)：①細(xì)胞標(biāo)本在整個(gè)過(guò)程中要盡量保持新鮮，采用有效措施防止表面抗原消失和細(xì)胞死亡；②熒光標(biāo)記物用前應(yīng)用濾膜或高速離心去除顆�；虺猎�以減少非特異性干擾；③細(xì)胞標(biāo)本染色前應(yīng)除死細(xì)胞；④為提高靈敏度可用三步間接染色法。

　　（3）免疫熒光標(biāo)本的特殊處理：

　�、偎兰�(xì)胞及碎片去除：樣品中不可避免地存在著死細(xì)胞及碎片，影響分析結(jié)果。對(duì)于血細(xì)胞可用FCM通過(guò)0^。散射的差異不經(jīng)染色而將死細(xì)胞分出棄除；對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞，由于其大小分布不均，可在樣品內(nèi)加少量PI染色后將死細(xì)胞去掉。一般情況下即可用儀器直接去除碎片，也可用血清沉降法去除大碎片，用離法去除小碎片。

　�、跇�(biāo)本的保存和固定：實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)樣品在染色或分析前需要保存一定的時(shí)間，有時(shí)甚至需要進(jìn)行固定。

　　未染色的新鮮標(biāo)本貯存方法如下：10%二甲基亞砜，90%小牛血清，5×10^6～1×10⁷細(xì)胞在-70^℃過(guò)夜，然后置液氮中可長(zhǎng)期保存。

　　免疫染色未經(jīng)固定的標(biāo)本在4^℃可保存48h。若需存放時(shí)間較長(zhǎng)、或標(biāo)本具有傳染性，應(yīng)該用固定劑固定。常用的固定劑配方是：1%～4%的多聚甲醛和PBS或0.8%的生理鹽水配成p H7.2的固定液；或用0.37%～1.5%甲醛和PBS配成p H7.4的固定液。固定方法是：將經(jīng)免疫熒光染色的細(xì)胞離心沉淀，再加入固定液混勻，放在4^℃溫度保存。一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)固定處理的標(biāo)本保存1周至2個(gè)月，多數(shù)樣品的陽(yáng)性細(xì)胞群體比例及熒光強(qiáng)度增色能保持在正常范圍之內(nèi)。

　　（4）主要檢測(cè)的免疫指標(biāo)：

　�、偌�(xì)胞毒試驗(yàn)：細(xì)胞毒是機(jī)體的一種免疫監(jiān)督機(jī)制，細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)是一項(xiàng)重要的免疫指標(biāo)。例如天然殺傷細(xì)胞NK（Natural killer）是一種引起免疫媒介的效應(yīng)物，在抗腫瘤及感染因子的免疫監(jiān)督系統(tǒng)中起著重要作用。研究表明，對(duì)NK細(xì)胞的測(cè)量可以做為免疫治療監(jiān)測(cè)的重要參數(shù)和有效的預(yù)后征狀的指標(biāo)。所使用的熒光探針為CFDA（Caboxy-fluorescein diacetate）。

　�、谕淌晒δ軐�(shí)驗(yàn)：?jiǎn)魏送淌杉?xì)胞系統(tǒng)是機(jī)體的主要防御系統(tǒng)。FCM可以快速、定量地檢查吞噬細(xì)胞的吞噬能力和速度。

　　③I型變變態(tài)反應(yīng)的IgE受體細(xì)胞、IgE結(jié)合因子的檢查。

　�、馨麧{Ig及血清Ig分析，血小板表面的IgG測(cè)定，等等。

　　3．在臨床方面的應(yīng)用FCM在臨床診斷、療效評(píng)價(jià)和預(yù)后預(yù)測(cè)等方面都發(fā)揮了一定的作用。工作做得較多的主要在腫瘤學(xué)、血液病學(xué)等。這些都和FCM在熒光細(xì)胞化學(xué)中的直接應(yīng)用有關(guān)。

　�。�1）癌前病變的檢測(cè)和預(yù)后評(píng)價(jià)：有效地發(fā)現(xiàn)癌前病變而給予阻斷治療，無(wú)疑是腫瘤防治的重要環(huán)節(jié)　。FCM的探測(cè)對(duì)象主要是癌前細(xì)胞，即那些處于正常細(xì)胞向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的量變階段、尚未達(dá)到質(zhì)變的細(xì)胞。研究表明，除心肌、肝組織及精子細(xì)胞外，人類正常的體細(xì)胞都具有恒定的DNA二倍體含量，而那些癌前細(xì)胞和癌細(xì)胞則在其發(fā)生發(fā)展過(guò)程中伴有DNA含量變化異常。另在資料表明：癌前病變向癌變的轉(zhuǎn)化發(fā)生率與細(xì)胞的不典型增生程度有關(guān)，而細(xì)胞的不典型增生程度又與DNA含量的異常改變呈平行關(guān)系。利用FCM可以定量地測(cè)出癌前細(xì)胞的DNA含量并根據(jù)DNA分布直方圖直觀地反映出細(xì)胞的周期分布狀態(tài)，從而了解到癌前細(xì)胞增殖能力變化的動(dòng)態(tài)過(guò)程，這樣便可以獲得一些從組織形態(tài)學(xué)中難以得到的信息。

　　表10-1 是以胃粘膜為例比較正常細(xì)胞和胃癌細(xì)胞在DNA含量及細(xì)胞周期分布方面的差異。

表10-1　正常與胃癌的胃粘膜細(xì)胞DNA含量方面的差異

　　從表中看出差異是顯著的。我國(guó)一些學(xué)者也提出有關(guān)FCM診斷癌腫細(xì)胞的細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)，并已付之臨床應(yīng)用。

　　目前，對(duì)于癌癥病人預(yù)后評(píng)估的主要依據(jù)是病理組織學(xué)分級(jí)和臨床分期等指標(biāo)，不少人已認(rèn)識(shí)到用FCM來(lái)檢測(cè)DNA是對(duì)腫瘤預(yù)后評(píng)價(jià)的一個(gè)較為客觀有效的指標(biāo)。總的傾向是：異倍體的出現(xiàn)是惡性腫瘤的一個(gè)標(biāo)志；異倍體腫瘤的惡性程度高、復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高及死亡率高；二倍體及近二倍體腫瘤預(yù)后較好。

　　在臨床血液學(xué)方面的應(yīng)用目前也以血液系統(tǒng)的腫瘤診斷、分型和預(yù)后關(guān)系等方面的應(yīng)用為主；其主要技術(shù)途徑也是基于對(duì)DNA倍體分析和細(xì)胞增殖周期的分析。限于篇幅不再多敘。有關(guān)的技術(shù)細(xì)節(jié)　將在下節(jié)　以FCM在外周血白細(xì)胞的免疫組織化學(xué)分析方面的應(yīng)用為例詳加介紹。

　　（2）DNA指數(shù)：由于DNA的非整倍體細(xì)胞是腫瘤的特異性標(biāo)志已經(jīng)得到腫瘤學(xué)界的公認(rèn)，在些學(xué)者提出建議采用流式細(xì)胞術(shù)DNA分級(jí)指數(shù)（Flow cytometry DNA Crading Index, 簡(jiǎn)稱DNA指數(shù)或DI）表示DNA含量的異常程度。根據(jù)1984年分析細(xì)胞學(xué)會(huì)名詞審定委員會(huì)的規(guī)定：

　　一般樣品應(yīng)采用同種或同個(gè)體的正常細(xì)胞為標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞。在血液學(xué)研究中通常以正常人外周血淋巴細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)二倍體細(xì)胞。需要指出的是，在報(bào)告DNA的測(cè)定結(jié)果時(shí)必需包括G₀/G₁峰的變異和系數(shù)，即C.V值，若有多個(gè)DNA干系則要給出各個(gè)G₀/G₁峰的C.V值。用于腫瘤臨床診斷的總體依據(jù)是：a.正常二倍體的DI=1.0，判斷為陰性；b.出現(xiàn)二個(gè)或多個(gè)可以分辨的G₀/G₁峰則可判斷為陽(yáng)性；c.雖無(wú)明顯的G₀/G₁峰的分化現(xiàn)象，但峰的C.V值較大，則可根據(jù)DI數(shù)個(gè)及其它有鑒別意義的征狀給出參考性的診斷。

　　以上我們主要從FCM在生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用的基本原理和技術(shù)途徑介紹了和組織化學(xué)有關(guān)的內(nèi)容，至于一些技術(shù)細(xì)節(jié)　則在下節(jié)　做較為詳細(xì)的說(shuō)明。

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第三節(jié)　FCM對(duì)外周白細(xì)胞的免疫熒光分析

　　外周血是臨床檢驗(yàn)中的重要標(biāo)本。FCM分析外周白細(xì)胞的主要目的是了解各種白細(xì)胞的數(shù)目與分群情況。這些數(shù)字的變化與臨床的某些疾病有一定的關(guān)系。近年來(lái)，由于多種識(shí)別白細(xì)胞膜表面抗原的單克隆抗體的發(fā)現(xiàn)，以及對(duì)這些單克隆抗體的直接或間接熒光標(biāo)記物的出現(xiàn)，使得利用FCM的熒光組織化學(xué)分析獲得被測(cè)細(xì)胞的多指標(biāo)的更多、更準(zhǔn)確的信息，這無(wú)疑對(duì)警覺(jué)臨床和科研有很大幫助。本節(jié)　主要討論有關(guān)外周血的白細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記技術(shù)、數(shù)據(jù)分析及臨床應(yīng)用等方面的問(wèn)題。

　　一、白細(xì)胞的免疫熒光標(biāo)記技術(shù)

　　1．白細(xì)胞抗原下面給出世界衛(wèi)生組織對(duì)白細(xì)胞抗原的統(tǒng)一命名，以及它們的分子量、對(duì)應(yīng)的單克隆抗體及反應(yīng)陽(yáng)性的細(xì)胞（見(jiàn)表10-2）。

表10-2　WHO對(duì)白細(xì)胞分化抗原的命名

　　a：急性淋巴細(xì)胞性白血��；b：慢性淋巴細(xì)胞性白血病。

　　2．樣品的制備供FCM分析的樣品是單細(xì)胞懸液，而且大部分樣品都需經(jīng)熒光染色。樣品的制備方法大致有三種：①用熒光單克隆抗體染全血，隨后溶解紅細(xì)胞；②紅細(xì)胞溶解后染色；③通過(guò)梯度離心法分離出單個(gè)淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞，再將之制成細(xì)胞懸液染色。

　�。�1）全血染色后溶解紅細(xì)胞：由于不少血液標(biāo)本具有生物危害性，用此方法可以將染色、溶解、固定、分析幾個(gè)步驟都在一個(gè)試管內(nèi)進(jìn)行，這樣減少轉(zhuǎn)換過(guò)程中的污染。而且此法比用梯度離心分離出單個(gè)核細(xì)胞更節(jié)　省時(shí)間。由于此法未將粒細(xì)胞去除，故在用FCM分析時(shí)，要注意排除粒細(xì)胞的干擾。

　　具體操作步驟如下：

　　①全血100～150μl，放入5ml試管，并用50～100μl PBS稀釋，總體積為200μl。]

　�、跓晒鈽�(biāo)記的單克隆抗體染色30min，4^℃（或放于冰上）。單克隆抗體的濃度因不同來(lái)源差異很大，但為了使用方便，可按其說(shuō)明書(shū)配成每次實(shí)驗(yàn)使用10μl。注意蔽光。

　�、塾�3～4μl冷BPS清洗。離心250×g（約每分鐘1500轉(zhuǎn)），5min，洗3次。注意每次用吸管將上清吸出，決不能傾倒去液！

　�、苡�2ml氯化銨液（配法見(jiàn)下）在室溫下溶解紅血球，約10min。若紅細(xì)胞完全被溶解，溶液由混濁變到透明。注意溶解程度的掌握十分重要：若溶解過(guò)分，則導(dǎo)致白細(xì)胞上抗原被破壞，或者某些敏感的細(xì)胞死亡而導(dǎo)致比例的改變。若溶解不徹底，大量紅細(xì)胞會(huì)影響對(duì)淋巴細(xì)胞的分析。這是因?yàn)榱馨图?xì)胞在分析圖像上與紅細(xì)胞群接近，在框出淋巴細(xì)胞群時(shí)，會(huì)把部分紅細(xì)胞框定于淋巴細(xì)胞內(nèi)。而紅細(xì)胞溶解不足或過(guò)度在很大程度上影響著分析結(jié)果。

　　【氯化銨液的配制】

　　Tris—氯化銨1×氯化銨

　　0.16mol/L 　NH₄Cl 　　0.38g/100ml　 　90ml 　　0.16mol/L　　NH₄Cl

　　0.17mol/L 　Tris 　　2.06g/100ml 　　10ml　　0.17mol/l 　　Tris

　　pH值7.56 　　　　　　　　　　　　　　　　pH值7.2

　�、菁t細(xì)胞被徹底溶解，加入1ml PBS稀釋的0.5%甲醛，立即離心，洗3次，條件同步驟③。加入甲醛的目的是盡早固定細(xì)胞和細(xì)胞上的抗原，避免有生物危害的標(biāo)本到處污染。

　　⑥將染色完成的細(xì)胞懸浮于0.5～1ml的0.1%甲醛溶液內(nèi)。置4^℃，蔽光，等待分析。經(jīng)固定后的細(xì)胞在冰箱內(nèi)可保存一周，這樣對(duì)工作的安排會(huì)帶來(lái)方便。

　�。�2）紅細(xì)胞被溶解后再對(duì)白細(xì)胞染色：此方法的優(yōu)點(diǎn)是可以了解被染白細(xì)胞的數(shù)量以及存活率。但由于有時(shí)有些標(biāo)本比較敏感，溶解紅細(xì)胞后，還要經(jīng)過(guò)多個(gè)染色步驟，這樣容易造成抗原的喪失。此法具體步驟如下：

　　①室溫下放入14ml氯化銨在15ml的試管里。

　　②加入0.5～1ml全血，混合3～5min。

　�、哿⒓措x心100～150×g，并用PBS洗2次。

　�、馨准�(xì)胞計(jì)數(shù)，注意存活率應(yīng)在90%以上。做成每毫升含5×10⁶白細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞分配到5ml的試管，每試管0.2ml，即1×10⁶個(gè)細(xì)胞。

　�、轃晒鈽�(biāo)記的單克隆抗體染色30min，4^℃，避光�？贵w濃度配制如前所述。

　�、轕BS洗3次后，用0.5%甲醛固定。方法如前。

　�。�3）用Ficoll—Hypaque 梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞：用此法可以分離骨髓細(xì)胞、淋巴結(jié)、扁桃體搗碎后的單細(xì)胞懸液等。血液標(biāo)本應(yīng)有抗凝劑。取血到分離不能超過(guò)6h。

　�、倏鼓�全血4～20ml，用等量PBS或Hanks液稀釋。

　�、谙♂屟�8或40ml置于15或50ml離心管內(nèi)，4或10ml Ficoll—Hypaque（或者等量的其它分離液，比重為1.007）從離心管底部輕輕加入到血的下面。這種方法對(duì)血的擾動(dòng)較小，比將全血加到Ficoll上面為好。加完后，可以清楚看到Ficoll與全血之間有一明顯的分界線。注意在Ficoll快加完時(shí)應(yīng)特別小心，否則有可能加入氣泡攪混血樣，使血與分離液混合，達(dá)不到分離的目的。

　�、垭x心350～400g,30min。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞以及死細(xì)胞將位于離心管底部，中間層的單個(gè)核細(xì)胞為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些血小板。

　�、苋〕鲋虚g層中所有細(xì)胞，若在Ficoll中還有細(xì)胞也要取出，這也是單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）。

　　⑤用PBS洗3次，第1次清洗時(shí)，可用較快速400×g離心10min。因?yàn)橛锌赡苤虚g層中混有一些ficoll，比重增加而細(xì)胞不易沉降。

　�、轕BMC計(jì)數(shù)，注意存活率應(yīng)高于90%。配成5×10⁶個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液。

　　⑦取出0.2ml的懸浮液加入到5ml試管（內(nèi)含1×10⁶細(xì)胞），用熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，方法如前。洗3次后固定。注意必須先染色后固定，固定后的細(xì)胞膜通透性改變，會(huì)導(dǎo)致熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)入細(xì)胞中去，而在顯微鏡下觀察的染色效果則和死細(xì)胞一樣。當(dāng)用FCM分析時(shí)，則均為陽(yáng)性而達(dá)不到檢驗(yàn)?zāi)康�。這也是用FCM分析的細(xì)胞存活率應(yīng)高于90%的原因。

　�。�4）熒光標(biāo)記抗體的細(xì)胞染色：如前所述，F(xiàn)CM分析被熒光標(biāo)記的抗體染色的細(xì)胞，在選擇熒光染料時(shí)必須注意這些熒光染料所需要的激發(fā)光波長(zhǎng)是否與所使用的FCM的激發(fā)光譜相匹配。一般各個(gè)公司所采用的綠色熒光染料為FITC，而選用的紅色熒光染料卻不盡相同，有的用TRITC，有的用藻紅蛋白（PE），所需要的激發(fā)光譜就不一樣，因而若因匹配不當(dāng)則會(huì)招致熒光抗體所染的細(xì)胞分析不出來(lái)，這是應(yīng)該注意的。

　　這里的標(biāo)本染色方法和免疫熒光法相同。下面僅說(shuō)明一些具體的注意事項(xiàng)：

　　①在用間接法染色時(shí)，染色步驟依次為抗體→清洗→第二抗體→清洗→紅細(xì)胞溶解。為了實(shí)驗(yàn)的方便，將第二抗體也配成每次實(shí)驗(yàn)用10μl。

　　②雙色法：雙色法多用于直接染色法。將分別用FITC和PE標(biāo)記的抗體各10μl置入同一個(gè)含有約1×10⁶/0.2ml的試管內(nèi)，30min，4℃避光。然后清洗、固定。

　　目前不少制備單克隆抗體的公司已將比值有意義的兩種抗體，分別用紅、綠熒光染料標(biāo)記后，制成一種試劑。如CD₂—FITC/CD₂₀—PE；CD₄-FITC/CD₈-PE等�？砂凑f(shuō)明使用，具體用量為每次實(shí)驗(yàn)10μl。

　　③對(duì)照組：眾所周知，免疫組化的染色過(guò)程中，陰性和陽(yáng)性對(duì)照是必不可少的。在準(zhǔn)備用FCM分析的細(xì)胞時(shí)，對(duì)照標(biāo)本的制備顯得格外重要。因?yàn)橐淮斡肍CM分析的樣品可能會(huì)很多，甚至多達(dá)上百個(gè)試管。對(duì)同一病人也可能會(huì)用到20～30個(gè)不同的單克隆抗體。每一個(gè)病人都要有相應(yīng)的陰性對(duì)照。陰性對(duì)照主要用于儀器分析細(xì)胞之前，設(shè)立陰性和陽(yáng)性的分界線。陽(yáng)性對(duì)照主要用于檢查染色方法。陽(yáng)性對(duì)照細(xì)胞選自那些已知的細(xì)胞和已知的單克隆抗體中的陽(yáng)性反應(yīng)*明顯者。陰性對(duì)照細(xì)胞有以下幾種：

　　1）非染色細(xì)胞：直接染色法時(shí)，用10μl PBS代替與熒光結(jié)合的單克隆抗體，其它步驟相同。間接染色法時(shí)，分別用10μl的PBS代替抗體和熒光第二抗體，其它步驟相同。

　　2）使用非特異性的抗小鼠膜表面免疫球蛋白（MsIg），代替特異性的單克隆抗體。這是由于所使用的單克隆抗體來(lái)自小鼠，可能造成非特異性的假性反應(yīng)，因此使用MsIg作為對(duì)照。同時(shí)還需要注意選擇與實(shí)驗(yàn)用單克隆抗體亞類一致的MsIg。如大部分單克隆抗體為IgG1，也有部分抗體為IgM，所以用MsIg作對(duì)照組時(shí)，往往使用MsIgG和MsIgM兩種。直接染色法時(shí)，用10μl與熒光結(jié)合的MsIg，代替熒光單克隆抗體。間接染色時(shí)，用10μl無(wú)熒光的MsIg代替抗體。其它步驟與實(shí)驗(yàn)組相同。

　　3）雙染色對(duì)照：將各10μl 的分別與紅熒光染料和綠熒光染料結(jié)合的MsIgg 或MsIgM，加入到同一個(gè)試管，代替熒光的特異性單克隆抗體，其它步驟相同。

　　4）間接法對(duì)照：用10μl的PBS代替抗體。熒光第二抗體的濃度和使用量均與其它實(shí)驗(yàn)相同，其它實(shí)驗(yàn)步驟也和實(shí)驗(yàn)組相同。

　　二、白細(xì)胞免疫熒光分析的數(shù)據(jù)分析

　　在儀器調(diào)試和校準(zhǔn)及標(biāo)本制備完畢之后，就要做測(cè)試和數(shù)據(jù)分析工作。這里先討論一下有關(guān)數(shù)據(jù)測(cè)量和分析的技術(shù)問(wèn)題，而一些醫(yī)學(xué)應(yīng)用的具體參數(shù)的測(cè)量和分析后面做介紹。

　　1.0^。散射和90^。散射的雙指標(biāo)的二維圖像分析　　可以把0^。和90^。散射分別選作二維圖像的X軸和Y軸指標(biāo)。通過(guò)圖中數(shù)據(jù)點(diǎn)分布把全血分為淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞幾個(gè)亞群（圖10-9）。

　　圖中，A、B圖的淋巴細(xì)胞數(shù)大約有6000～9000個(gè)；C、D圖約有2000～4000個(gè)。分群編號(hào)依次表示：①紅細(xì)胞、死細(xì)胞和渣滓；②淋巴細(xì)胞群；③大顆粒淋巴細(xì)胞；④單核細(xì)胞；⑤粒細(xì)胞。數(shù)據(jù)是對(duì)1000個(gè)細(xì)胞分析得到的。

　　若用單指標(biāo)直方圖，對(duì)PBMC而言，可以把淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞分開(kāi)。見(jiàn)圖10-10中的A、B圖。但對(duì)紅細(xì)胞溶解后的全血，單指標(biāo)圖分辨率則不夠了（圖10-10的C、D圖），圖A、B給出的是經(jīng)ficoll后的PBMC；圖C、D給出的是人外周血白細(xì)胞。圖中數(shù)字編號(hào)所代表的組分和圖10-9相同。

　　由上可見(jiàn)，在分析紅細(xì)胞溶解后的全血時(shí)，必須先采用雙指標(biāo)二維點(diǎn)圖。從圖上也可清楚地看出，粒細(xì)胞、未被溶解的紅細(xì)胞和一些渣滓，由于不同的體積和致密度，明顯地區(qū)別于淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞從而能把它們分開(kāi)。看到清楚的細(xì)胞分群以后，可以在計(jì)算機(jī)的顯示屏上將所要分析的細(xì)胞畫線框出，并通過(guò)指令送入存貯器，以后就可只對(duì)框出部分做各種數(shù)據(jù)分析和深入考查。圖10-11就是對(duì)雙指標(biāo)點(diǎn)圖上的淋巴細(xì)胞群框定的示意圖。數(shù)字所表示的意思和圖10-9相同。

　　2．單維直方圖上陰性分界游標(biāo)設(shè)置前面已經(jīng)強(qiáng)調(diào)，在用FCM分析時(shí)，陰性對(duì)照是必不可少的。首先用非染色細(xì)胞，根據(jù)前面介紹的雙指標(biāo)二維點(diǎn)圖的辦法，將某一細(xì)胞群框定；然后分別選用綠色熒光（GFL）和紅色熒光（RFL）單指標(biāo)直方圖。在直方圖上所出現(xiàn)的細(xì)胞均為陽(yáng)性�？捎酶淖僄FL和RFL增益的辦法，將細(xì)胞恰好調(diào)節(jié)　到左側(cè)并設(shè)立游標(biāo)（圖10-12）。

然后再測(cè)試MsIg染色的陰性對(duì)照。某些細(xì)胞，由于膜上的Fc受體可以與對(duì)照抗體鼠Ig非特異性結(jié)合，因而有一定的背景染色，不過(guò)這種陽(yáng)性百分率不應(yīng)超過(guò)5%。所以MsIg與非染色細(xì)胞的分界游標(biāo)確立后，以后所測(cè)試的標(biāo)本以此為標(biāo)準(zhǔn)，游標(biāo)位置基本不變。

　　MsIg的紅、綠熒光陰陽(yáng)性分界游標(biāo)確立以后，可以測(cè)試實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。首先檢查細(xì)胞分群情況，然后檢查淋巴細(xì)胞群是否落在已輸入計(jì)算機(jī)的淋巴細(xì)胞框定的范圍里。若染色及FCM的工作性能都正常，則框定的位置不會(huì)改變。然后轉(zhuǎn)換成熒光直方圖。若為FITC標(biāo)記的細(xì)胞，則GFL為X軸；若為PE標(biāo)記的細(xì)胞，則用RFL為X軸。由于陰陽(yáng)性分界游標(biāo)記已確立，細(xì)胞陽(yáng)性率及圖像均顯示于計(jì)算機(jī)熒光屏上；同時(shí)也可選用其它指標(biāo)和圖像、打印所需的資料等。

　　3．雙染色分析游標(biāo)設(shè)立和熒光校正

　�。�1）游標(biāo)的設(shè)立：游標(biāo)設(shè)立的原理和單染并無(wú)不同，但具體要用二維點(diǎn)圖和二維等高圖來(lái)完成。分別選用GFL和RFL為X和Y軸。先用不染色細(xì)胞測(cè)試，將陰性細(xì)胞集中在左下角（圖10-13）。分別為X、Y軸設(shè)立游標(biāo)，再用MsIg的陰性對(duì)照測(cè)試�？蓪�X、Y軸游標(biāo)略為移動(dòng)，使位于窗“3”內(nèi)的細(xì)胞（陰性）在95%以上。

　�。�2）紅、綠熒光的校正：由于紅色熒光探測(cè)器在*佳測(cè)試狀態(tài)時(shí)，會(huì)讓部分綠色熒光進(jìn)入紅色熒光探測(cè)器。這是因?yàn)橐徊糠旨?xì)胞發(fā)出的綠色熒光波長(zhǎng)較長(zhǎng)。若用阻斷或?yàn)V色的辦法消除進(jìn)入紅熒光探測(cè)器的這部分GRL，就會(huì)大大地降低RFL探測(cè)器的靈敏度。因而只好在操作時(shí)，通過(guò)電子計(jì)算機(jī)預(yù)入熒光校正，在RFL中適當(dāng)扣除GRL的影響。

　　通常紅色熒光進(jìn)入綠色熒光探測(cè)器的情況比較光見(jiàn)，圖10-14給出CD₁₁-PE（T細(xì)胞、RFL）及CD₈-FITC（T抑制細(xì)胞，GFL）雙染細(xì)胞在二維等高圖上進(jìn)行熒光校正的示意圖。X軸為GFL，Y軸為RFL，由X軸Y軸游標(biāo)劃分的四個(gè)窗的陰陽(yáng)性和圖10-13相同。各窗給出的百分?jǐn)?shù)為該細(xì)胞群所占百分比。圖A表示未經(jīng)校正時(shí)的情形。窗“2”內(nèi)31.46%表示雙陽(yáng)性細(xì)胞，即在T細(xì)胞中31.46%為抑制細(xì)胞毒細(xì)胞。經(jīng)過(guò)適當(dāng)校正，可見(jiàn)有兩群陽(yáng)性雙標(biāo)記細(xì)胞出現(xiàn)（B圖）。高強(qiáng)度部分為真正的CD₈、CD₁₁雙標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞；低強(qiáng)度部分屬于CD₈綠色陽(yáng)性細(xì)胞（NK細(xì)胞）。此時(shí)“2”窗中細(xì)胞份額減為7.59%。需要指出的是校正過(guò)度則會(huì)使各區(qū)的陽(yáng)性細(xì)胞都減少（圖C）。

1區(qū)：紅色熒光陽(yáng)性；2區(qū)�。杭t、綠熒光均為陽(yáng)性；3區(qū)：陰性細(xì)胞：4區(qū)：綠色熒光陽(yáng)性細(xì)胞

　　雙染色的熒光校正是用電子補(bǔ)償電路來(lái)完成的。補(bǔ)償時(shí)先測(cè)定一種染料的熒光，此時(shí)除了應(yīng)該接收該熒光的光電倍增管PMT₁有信號(hào)輸出外，另一光電倍增管PMT₂也常會(huì)有微弱輸出。調(diào)節(jié)　補(bǔ)償器使PMT₂的輸出為0；然后再測(cè)另一種波長(zhǎng)的熒光染料，調(diào)PMT_１的補(bǔ)償器使之輸出也為0；然后再測(cè)另一種波長(zhǎng)的熒光的染料，調(diào)PMT₁的補(bǔ)償器使之輸出也為0：如此反復(fù)調(diào)節(jié)　，使兩種熒光的探測(cè)器都獲得補(bǔ)償。實(shí)際調(diào)節(jié)　時(shí)用的是一種標(biāo)準(zhǔn)熒光微球，微球上標(biāo)有已知數(shù)量的熒光分子。利用不同的微球可調(diào)整、補(bǔ)償不同熒光的測(cè)量通道。需要指出的是：當(dāng)PMT高壓有所改變、激光和濾片系統(tǒng)有所變動(dòng)時(shí)，都要對(duì)熒光校正做重新補(bǔ)償調(diào)節(jié)　。

　　三、淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定及其在臨床醫(yī)學(xué)中的實(shí)用意義

　　淋巴細(xì)胞由于表面特異性抗原的差異可分為四大類（表10-3），這些不同抗原表現(xiàn)型的亞群執(zhí)行不同的機(jī)能。而且某些疾病會(huì)選擇性地?fù)p傷某些亞群而造成亞群之間的比例失調(diào)。根據(jù)FCM雙熒光分析的結(jié)果，現(xiàn)將不同的抗原和不同的機(jī)能的淋巴細(xì)胞亞群列于表10-4。

表10-13 主要淋巴細(xì)胞亞群的表面抗原

　　＋：表現(xiàn)的抗原；－：未表現(xiàn)的抗原；＋／－：主要亞群有表現(xiàn)的抗原；－／＋：抗原僅表現(xiàn)于少數(shù)亞群。

表10－14　淋巴細(xì)胞機(jī)能性亞群

　　外周血白細(xì)胞的機(jī)能，特別是淋巴細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)在一定程度上反應(yīng)了機(jī)體的免疫機(jī)能。近幾年來(lái)，用FCM來(lái)測(cè)定某些疾病的淋巴細(xì)胞及其亞群已成為重要的診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)，如對(duì)骨髓、器官移植，白血病、淋巴瘤的診斷和對(duì)免疫缺陷病的估價(jià)等。測(cè)定淋巴細(xì)胞亞群的主要依據(jù)是在于淋巴細(xì)胞表面不同的抗原表現(xiàn)型，而這些表現(xiàn)型又依賴于相應(yīng)的單克隆抗體而被識(shí)別。所以，特異性很高的單克隆抗體結(jié)合的FCM，已為臨床提供了不少非常有用而重要的資料，但被FCM所分析的淋巴細(xì)胞的整個(gè)臨床意義尚未完全認(rèn)識(shí)清楚。隨著更多確定淋巴細(xì)胞表現(xiàn)型的試劑的應(yīng)用，F(xiàn)CM對(duì)診斷和治療計(jì)劃的擬定以及預(yù)后的估計(jì)將會(huì)表現(xiàn)出更重要的實(shí)用意義。

　　1．T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定如前所述，在使用FCM分析時(shí)，先用0^。散射和90^。光散射雙指標(biāo)將白細(xì)胞分為三群：淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和粒細(xì)胞。在二維點(diǎn)圖上劃出淋巴細(xì)胞群范圍后，設(shè)立GFL的RFL單指標(biāo)的直方圖。命電子計(jì)算機(jī)僅計(jì)數(shù)所輸入的淋巴細(xì)胞，即劃線框出的那部分細(xì)胞。一般計(jì)數(shù)輸入的細(xì)胞可設(shè)1000～5000個(gè)。直方圖的分析可顯示陽(yáng)性細(xì)胞的百分率。應(yīng)用輸入細(xì)胞數(shù)、陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)以及白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，就能得到陽(yáng)性細(xì)胞的絕對(duì)值，即每立方毫米血液中的絕對(duì)值。有時(shí)T淋巴細(xì)胞某亞群的絕對(duì)值比百分率更為重要，因?yàn)樗�可以表明T細(xì)胞某亞群的增高和減少。當(dāng)然，淋巴細(xì)胞占白細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)也是一個(gè)重要數(shù)據(jù)，應(yīng)當(dāng)準(zhǔn)確測(cè)出。

　　CD₄/CD₈細(xì)胞的比值，有時(shí)也用于反映病人淋巴系統(tǒng)的機(jī)能狀態(tài)。不少臨床免疫實(shí)驗(yàn)室已把CD₄/CD₈的值作為常規(guī)血檢查的項(xiàng)目。在上，淋巴細(xì)胞亞群以及CD₄/CD₈并未建立統(tǒng)一數(shù)值，各實(shí)驗(yàn)室均需建立自己的標(biāo)準(zhǔn)。平均值一般為1.73～2.00。

　　一般而言，影響淋巴細(xì)胞亞群的因素較多，如年齡、性別、種族、以及外周圍環(huán)境如季節(jié)　、藥品等的影響。T細(xì)胞的絕對(duì)值在兒童略高于成人。嬰兒CD₄細(xì)胞的百分率較成年人高；老年人的CD₈略低。正常人在一晝夜內(nèi)也有周期性的波動(dòng)：上午CD₄略低，下午4時(shí)之后開(kāi)始增加，直至次晨，平均波動(dòng)為15%～20%。盡管正常情況下淋巴細(xì)胞亞群有所變動(dòng)，但仍屬正常范圍。某些疾病，如器官移植、免疫疾病、免疫抑制和一些淋巴細(xì)胞腫瘤，其淋巴細(xì)胞亞群及其比值測(cè)量結(jié)果均可能偏離正常范圍。

　　有工作報(bào)道，傳統(tǒng)的T輔助誘導(dǎo)細(xì)胞（CD₄⁺）具有抑制機(jī)能，而在T抑制細(xì)胞毒細(xì)胞（CD₄⁺）中，有些又具有協(xié)助的功能。因此，對(duì)原來(lái)設(shè)想的CD₄、CD₈的機(jī)能分群有所混淆。預(yù)計(jì)會(huì)有新的單克隆抗體再?gòu)腃D₄和CD₈的細(xì)胞中分出。不過(guò)就目前看來(lái)，不少臨床免疫實(shí)驗(yàn)室已用CD₄/CD₈比值結(jié)合淋巴細(xì)胞絕對(duì)值對(duì)多種疾病的診斷、治療和預(yù)后的估計(jì)提供了不少有價(jià)值的資料。

　　2．艾滋病以及HLTV—III感染艾滋病是一種由人類T淋巴細(xì)胞病毒（HLTV－－III）感染而造成的疾病。這種病毒主要侵襲CD₄⁺T細(xì)胞，而導(dǎo)致CD₄淋巴細(xì)胞減少，CD₄/CD₈淋巴細(xì)胞比值下降，甚至可低到0.5以下。艾滋病多發(fā)生在同性戀性行為活躍的男性，這可能與多次重復(fù)感染HLTV-III有關(guān)。對(duì)異性性行為活躍的人來(lái)講，對(duì)HLTV—IIi 感染的機(jī)會(huì)也不容忽視。另一種感染的途徑是HLTV血清陽(yáng)性的獻(xiàn)血者對(duì)受血者的感染。有部分人血液中T淋巴細(xì)胞減少，CD₄/CD₈比值下降，但HTLV血清反應(yīng)不一定就是陽(yáng)性。有些人CD₄減少不明顯，但CD₈有所增加，也會(huì)導(dǎo)致CD₄/CD₈的的比值下降。

　　對(duì)可疑為艾滋病及血清檢驗(yàn)為陽(yáng)性的人，T細(xì)胞亞群是分析了解免疫系統(tǒng)被病毒破壞程度的標(biāo)志。初診時(shí)，CD₄細(xì)胞越少，CD₄/CD₈值越低者，預(yù)后越差。所以經(jīng)治療后恢復(fù)的指標(biāo)則是CD₄細(xì)胞數(shù)增加，CD₄/CD₈比值升高。用熒光標(biāo)記雙染色的FCM分析的結(jié)果表明，艾滋病人除CD₄和CD₈的改變外，同時(shí)還可以表現(xiàn)出OKT₁₀陽(yáng)性細(xì)胞增多（圖10-15）。病人表現(xiàn)為CD₈和OKT₁₀同時(shí)增加時(shí)，預(yù)后比OKT₁₀陽(yáng)性細(xì)胞低的病情嚴(yán)重。

艾滋病人Leu₃⁺、Leu₈^-和Leu₃⁺、Leu₈⁺細(xì)胞均減少，而Leu₂⁺、Leu₈^-細(xì)胞相應(yīng)增加，

Leu₂⁺、Leu₇⁺與Leu2₃⁺、Leu₁₀⁺細(xì)胞明顯增加

　　3．白血病和淋巴瘤的表現(xiàn)型　近年來(lái)，為了弄清這些腫瘤的病理組織形態(tài)、影響治療效果的原因與免疫狀態(tài)的相互關(guān)系，對(duì)于不同類型的白血病和淋巴瘤作為廣泛的細(xì)胞表面表現(xiàn)型的研究。

　　在診斷方面，F(xiàn)CM與單克隆抗體結(jié)合，可以弄清這些腫瘤的免疫起源，特別是分清B細(xì)胞性、T細(xì)胞性或骨髓性腫瘤。同時(shí)，還可以證實(shí)一些與細(xì)胞起源相關(guān)的抗原，如普通急性淋巴細(xì)胞性白血病抗原（CALLA、CD₁₀）。另外，可以用適當(dāng)?shù)脑噭�從反�?yīng)免疫過(guò)程中來(lái)證實(shí)單克隆的腫瘤細(xì)胞的增殖。

　　大部分淋巴系統(tǒng)腫瘤均起源于B細(xì)胞。而B(niǎo)細(xì)胞腫瘤常用抗免疫球蛋白的抗體來(lái)證實(shí)。由于前B細(xì)胞與漿細(xì)胞表面均無(wú)免疫蛋白，所以用檢測(cè)免疫球蛋白的辦法就只能證實(shí)B細(xì)胞發(fā)育中間時(shí)期的腫瘤。目前，已有一系列的B細(xì)胞表面抗原被發(fā)現(xiàn)，而可以證實(shí)B細(xì)胞個(gè)體發(fā)育的各個(gè)時(shí)期的腫瘤。

　　對(duì)B細(xì)胞腫瘤*有價(jià)值的抗原是CALLA。這種抗原僅存在于B細(xì)胞正常以育期的前B細(xì)胞、早期B細(xì)胞以及80%～90%的急性淋巴細(xì)胞性白血病。因此，抗CALLA抗體可以區(qū)別淋巴細(xì)胞性和髓性白血病。用抗CALLA結(jié)合其它一些成熟B細(xì)胞的單克隆抗體，如CD₁₉，CD₂₀，CD₂₄（B₄，B₁，BA_-1）將能證實(shí)大部分B細(xì)胞來(lái)源的腫瘤。圖10-16給出了B細(xì)胞分化的各個(gè)時(shí)期細(xì)胞膜的表現(xiàn)型。來(lái)源于B細(xì)胞的腫瘤和正常B細(xì)胞的表現(xiàn)型相似，也就是說(shuō)，B細(xì)胞前身、成熟B細(xì)胞及*后分化為分泌B細(xì)胞—漿細(xì)胞。

　　由于T淋巴細(xì)胞來(lái)源的腫瘤浸潤(rùn)性較強(qiáng)，預(yù)后較差，并需要多種治療。T細(xì)胞腫瘤的表現(xiàn)型千變?nèi)f化，但大部分均表現(xiàn)T細(xì)胞抗原CD₇（Leu₉,3A）或其它T細(xì)胞抗原CD₂、CD₅（OKT₁₁，OKT₁）。這些抗原與腫瘤的細(xì)胞成熟時(shí)間有關(guān)，因而有助于擬定治療方案。從FCM分析的結(jié)果表明，非成熟的T細(xì)胞腫瘤常表現(xiàn)非成熟的T細(xì)胞抗原，如CD₁和t ₁₀。而成熟的T 細(xì)胞腫瘤則僅表現(xiàn)成熟T細(xì)胞抗原：CD₂、CD₃、CD₅和CD₇。有時(shí)也可表現(xiàn)CD₂、CD₈，但不會(huì)出現(xiàn)在同一個(gè)細(xì)胞上面。

　　由于腫瘤細(xì)胞的多種來(lái)源，很難避免在腫瘤標(biāo)本中混雜正常細(xì)胞，這給FCM的分析帶來(lái)技術(shù)上的困難。如殘留的紅細(xì)胞在FCM分析時(shí)，落入淋巴細(xì)胞框定的范圍內(nèi)而造成淋巴細(xì)胞各種亞群百分率下降。所以在制備標(biāo)本時(shí)，應(yīng)盡量想法去除紅細(xì)胞。另一種污染是正常細(xì)胞存在于腫瘤細(xì)胞之間，這是一個(gè)很頭痛的問(wèn)題。例如骨髓常被外周血污染，反應(yīng)性的正常淋巴細(xì)胞滲入到腫瘤組織中等，因此估計(jì)污染程度對(duì)解釋FCM分析的資料有一定的意義。因?yàn)樵贔CM分析時(shí)，正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞可能由于不同的體積和密度而被分開(kāi)，根據(jù)對(duì)污染的估計(jì)，仔細(xì)分析圖像就能得到比較正確的結(jié)果。

　　4．FCM對(duì)正常B細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤分析　　FCM對(duì)正常B細(xì)胞和B細(xì)胞腫瘤的分析在免疫學(xué)研究和臨床診斷上有著重要的實(shí)用價(jià)值，B細(xì)胞的某些特征必須使用FCM來(lái)分析，但是這在FCM技術(shù)方法中仍存在著一些需要解決的問(wèn)題。

　�。�1）B細(xì)胞的標(biāo)記：B細(xì)胞膜表現(xiàn)免疫球蛋白（SIg）存在于所有成熟B細(xì)胞。*早的B細(xì)胞前身，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有免疫球蛋白M（IgM），但不存在于細(xì)胞膜表面。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IgM的證實(shí)以及同時(shí)測(cè)定細(xì)胞表面的SIg，對(duì)FCM是很困難的，當(dāng)然今后可能會(huì)用雙染法來(lái)解決這樣的難題。大部分成熟B細(xì)胞具有SIgM和SIgD，少量具有SIgG和SIgA，當(dāng)然這也可能是因?yàn)椴煌�的亞群的緣故。但僅以Ig的重鏈來(lái)分類B細(xì)胞是不可靠的，因?yàn)锽細(xì)胞可以從膜表面的IgM逐漸轉(zhuǎn)變成IgG，因而從重鏈著手無(wú)法把B細(xì)胞分類。大部分B細(xì)胞腫瘤也表現(xiàn)出帶有SIgM和SigD。隨著B(niǎo)細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變成漿細(xì)胞，膜表面Ig 逐漸喪失，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)又出現(xiàn)大量的免疫球蛋白。

　　與重鏈相反，B細(xì)胞的整個(gè)發(fā)生期只有一種k或者λ輕鏈，B細(xì)胞腫瘤克隆僅表現(xiàn)一種輕鏈，因此通過(guò)在FCM上顯示的不平衡的輕鏈表現(xiàn)可以確定B細(xì)胞腫瘤。測(cè)定方法見(jiàn)（3）。

　　用SIg的缺點(diǎn)是它的“嗜細(xì)胞性”，因?yàn)檎�常B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）、激活T細(xì)胞以及所有巨噬細(xì)胞均有Fc段受體，因而可以不同程度地與抗SIg單克隆抗體的Fc段結(jié)合而產(chǎn)生非特異性的結(jié)果，因此選擇抗體時(shí)，應(yīng)使用已被胃蛋白酶消化過(guò)的、Fc段也被去除的、僅留下來(lái)的F（ab’）₂。

　�。�2）FCM測(cè)定B細(xì)胞的臨床指證：

　�、倜庖呷毕荩幻庖呷毕菘梢允窍忍煨曰颢@得性的。低丙種球蛋白白血癥和無(wú)丙種球蛋白白血癥常伴有免疫球蛋白分泌的紊亂，因此有必要分析B細(xì)胞。

　�、诹馨土觯悍呛谓芙鹗喜〉牧馨筒。�80%來(lái)源于B細(xì)胞。因而一旦懷疑為淋巴瘤，就應(yīng)仔細(xì)用FCM對(duì)B細(xì)胞的表現(xiàn)型進(jìn)行分析，可以分析血、骨髓、以及活檢淋巴結(jié)等。首先確定腫瘤細(xì)胞的來(lái)源：B細(xì)胞性（CD₂₀⁺，SIg⁺）或T細(xì)胞性（CD₃⁺）。也有可能某些淋巴病來(lái)源于單核細(xì)胞（CD₁₁⁺）成裸細(xì)胞而表現(xiàn)出非T非B。一旦確立為B細(xì)胞來(lái)源后，就應(yīng)更進(jìn)一步分析克隆增殖的性質(zhì)：?jiǎn)慰寺　⑸倏寺�、或是多克降珠。單克隆性的增殖往往是腫瘤的標(biāo)志�？梢杂肧Ig的輕鏈和重鏈分別加以測(cè)試，往往輕鏈比重鏈更有價(jià)值。在不久的將來(lái)，或許可以直接用免疫球蛋白的基本加以鑒別。

　　對(duì)B細(xì)胞亞群的確定，目前并未定論，但某些B細(xì)胞被CD₅（T₁，OKT₁）染色。正常B細(xì)胞中這些細(xì)胞較少，而多見(jiàn)于慢性淋巴性白血病和骨髓移植后的免疫缺陷時(shí)期。在B細(xì)胞的腫瘤病人中，10%的也可以出現(xiàn)CD₂₀（B₁）陰性反應(yīng)，這是B細(xì)胞成熟而將分化為漿細(xì)胞的標(biāo)志。在異常B細(xì)胞上，往往有一些B細(xì)胞的標(biāo)記缺失或其它表現(xiàn)型出現(xiàn)，因而對(duì)異常B細(xì)胞的FCM的分析尤為重要。圖10-17顯示CD₁₉—FITc （B細(xì)胞）和CD₅-PE（T細(xì)胞）雙染色的假三維圖像分析。X軸為綠色熒光的Leu₁₂（B細(xì)胞），Y軸為紅色熒光的PE—Leu₁（T細(xì)胞）。從圖中可見(jiàn)，有較多的細(xì)胞表現(xiàn)出Leu₁₂⁺t Leu₁⁺,陰性區(qū)內(nèi)為NK細(xì)胞和紅細(xì)胞等。

　�。�3）k-λ測(cè)定B細(xì)胞克隆：k、λ測(cè)定法是一種從正常B細(xì)胞中測(cè)定少量B細(xì)胞克隆生長(zhǎng)的方法。其基本原理是：若有B細(xì)胞克隆存在，將改變某一種輕鏈（k或λ）的熒光強(qiáng)度的分布。若輕鏈為k的B細(xì)胞生長(zhǎng)，則抗k的抗體能測(cè)試出這種變化，而抗λ的抗體的測(cè)試沒(méi)有任何改變。正常情況下，B細(xì)胞的k和λ的熒光強(qiáng)度分布是一致的（見(jiàn)圖10-18）。

正常情況，B細(xì)胞輕鏈分布圖像，一致κ和λ的波形沒(méi)有區(qū)別。但在異常時(shí)，若有單克隆生長(zhǎng)，κ鏈有分布則與λ不一致，在總和的曲線形態(tài)上也會(huì)產(chǎn)生差異。

　　在實(shí)際應(yīng)用中，血液、體液、組織細(xì)胞的懸浮液效果均較好，而對(duì)于骨髓，大量細(xì)胞的非特異性標(biāo)記會(huì)影響測(cè)定的結(jié)果。這里面必須強(qiáng)調(diào)，正常B細(xì)胞中的克隆細(xì)胞生長(zhǎng)并不意味著它們必然是腫瘤細(xì)胞，還必須結(jié)合其它指標(biāo)再做結(jié)論。不過(guò)這種方法對(duì)確定腫瘤細(xì)胞的存在、細(xì)胞發(fā)育階段、以及經(jīng)治療后病情控制的狀況等，都可以提供一些有用的資料。

　　以上僅限于從外周血的白細(xì)胞分析這一側(cè)面介紹了FCM的某些疾病中的臨床應(yīng)用。其實(shí)，它也僅只是問(wèn)題的一個(gè)部分。例如，有研究工作表明：CD₃₄抗原在由紅系、巨核系、粒系和巨噬細(xì)胞三個(gè)細(xì)胞成株單元組成的成株細(xì)胞中有所表現(xiàn)。CD₃₄⁺細(xì)胞在人的骨髓細(xì)胞中約占1～4%，而在外周血中卻探測(cè)不到。又如，NK細(xì)胞近來(lái)被認(rèn)為可能和人類的某些疾病的發(fā)病機(jī)理有關(guān)，對(duì)NK細(xì)胞的測(cè)量可以作為免疫治療的免疫監(jiān)測(cè)的重要參數(shù)和有效的預(yù)后征狀的指示。以前是用放射性的⁵¹Cr的釋放來(lái)檢測(cè)NK敏感的靶細(xì)胞的毒理學(xué)活性從而評(píng)估NK的功能的，而采用熒光探針CFDA（car－boxy—fluorescein diacetate）標(biāo)記則可用FCM技術(shù)更為安全可靠地進(jìn)行測(cè)定。有報(bào)告指出，健康男人的數(shù)值為（67.1±22.7%）%，健康女人為（63.9±20.0%）；患有婦科癌腫病人則為（38.5±23.1）%,明顯偏低。這些工作表明，F(xiàn)CM的技術(shù)從免疫組織化學(xué)角度還會(huì)有所發(fā)展。在第二節(jié)　我們?cè)��?jiǎn)單介紹了流式細(xì)胞分析技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)工程中應(yīng)用的一些技術(shù)途徑，這也可以啟發(fā)我們借助于FCM來(lái)提高免疫組織化學(xué)的分析能力�？梢灶A(yù)見(jiàn)，F(xiàn)CM一定會(huì)成為免疫組織化學(xué)的一項(xiàng)重要的技術(shù)工具，并將在醫(yī)學(xué)科研和臨床應(yīng)用中發(fā)揮更大的作用。

　　附【美國(guó)Becton –Dickinson 公司可提供的FCM標(biāo)準(zhǔn)】熒光微球（Fluorescent beads）；雞紅細(xì)胞核（Chicken erythrocyte nu－clei）和小牛胸腺細(xì)胞核（Calf thymocyte nuclei），用于DNA測(cè)量的質(zhì)量控制；單克隆抗體試劑；以及用于免疫表型（immunopheno－typing）和其它臨床應(yīng)用的藥盒。

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